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                              CRISPR/Cas9系統(tǒng)是當今基因編輯領域最熱門的明星工具，2013年，Broad研究所的兩個研究團隊分別在Science雜志同一期上發(fā)表了CRISPR文庫的相關研究。在此之后，基于CRISPR/Cas9的工具得到了快速發(fā)展，CRISPRa，CRISPRi及CRISPR敲除文庫已經(jīng)廣泛用于證明新的生物學機制，如耐藥性和細胞存活信號。多篇CNS(Cell、Nature、Science)連續(xù)報道。利用該技術(shù)，研究人員在藥物靶標發(fā)現(xiàn)、基因功能研究、藥物敏感基因研究等領域取得了巨大的成功。

1、服務內(nèi)容（以耐藥基因為例）

1）臨床問題提出，選定合適的研究目標，確定研究癌種與目標藥物。
2）個性化設計，全基因組篩選可能與藥物發(fā)揮拮抗作用的基因。
3）高通量測序及候選基因篩選
4）候選基因功能驗證：細胞水平、動物水平，臨床相關性等
5）數(shù)據(jù)庫檢索尋找候選增敏基因的小分子抑制劑，如有可進行成藥性研究，驗證藥物協(xié)同作用。

2、一般篩選流程（耐藥基因為例）

3、篩選優(yōu)點

快速準確的找到與某種表型相關的基因
靶點效率高
應用范圍廣
開發(fā)潛力大
4、現(xiàn)有CRISPR篩選文庫

人源lncRNA 激活庫Human CRISPR lncRNA Activation Pooled Library (SAM-3)

1、靶向激活10,504個lncRNA

2、包含96,458個sgRNA靶點

人源敲除庫Human CRISPR Knockout Pooled Library (GeCKO v2) 

1、靶向敲除19,050個mRNA 及1864個miRNA

2、包含123,411個sgRNA靶點

人源激活庫Human CRISPR Activation Library (SAM-2)

1、靶向激活23,430個mRNA

2、包含70,290個sgRNA靶點

小鼠敲除庫Mouse CRISPR Knockout Pooled Library (GeCKO v2)

1、靶向敲除20,611個mRNA 及1175個miRNA

2、包含130,209個sgRNA靶點

小鼠激活庫Mouse CRISPRa sgRNA library Caprano (P65-HSF)

1、靶向激活22,774 (Set A), 22,658 (Set B) 個mRNA

2、包含134,076個sgRNA靶點

其他個性化定制 CRISPR/cas9 慢病毒文庫

5、篩選案例

1）藥物靶標發(fā)現(xiàn)

Molecular Cancer（If 7.776）雜志8月份在線發(fā)表了廣州市第一人民醫(yī)院的文章，伊馬替尼是一種治療白血病及胃腸道間質(zhì)腫瘤的藥物，但往往產(chǎn)生耐藥，機制不明。在該研究中，研究人員運用CRISPR/Cas9全基因敲除文庫在胃間質(zhì)瘤中篩選并驗證了9個可能參與伊馬替尼耐藥的基因，可以用于深入探討伊馬替尼耐藥的分子機制。

“篩選”耐藥基因的思路

耐藥基因篩選、差異基因的通路富集分析

耐藥基因功能驗證

Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor
with Imatinib resistance. Molecular Cancer. 2018; 17(1):121-127.

     2018年4月份哈佛大學研究團隊在Cell雜志發(fā)表了運用CRISPR激活文庫篩選了化療耐藥相關的lncRNAs的研究論文。阿糖胞苷(Cytarabine, Ara-C)是一種治療AML的藥物，但往往產(chǎn)生耐藥，機制不明。作者利用CRISPR文庫原理構(gòu)建了同時篩選有功能的mRNA、lncRNA的sgRNA篩選技術(shù)，通過“隨機激活lncRNA、mRNA的轉(zhuǎn)錄表達”的方式，篩選針對AML的阿糖胞苷耐藥RNA。最后發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS6-AS2的激活會介導耐藥的產(chǎn)生，并通過體內(nèi)、外實驗驗證這一發(fā)現(xiàn)。

技術(shù)路線

耐藥基因篩選策略、差異基因的通路富集分析

富集lncRNA的關聯(lián)通路注釋

GAS6-AS2耐藥：體外功能驗證，預后分析

GAS6-AS2耐藥：體內(nèi)驗證

An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Cell. 2018; 173(3):649-664.e20.
 

2）自噬相關基因篩選

自噬是一種細胞內(nèi)降解過程，需要多個自噬相關（ATG）基因的參與。在這個研究中，東京國立癌癥中心研究所采用自噬流體報告基因GFP-LC3-RFP進行了全基因組CRISPR文庫篩選，并鑒定出新的ATG家族基因TMEM41B，并發(fā)現(xiàn)TMEM41B與VMP1在自噬體形成的早期階段一起發(fā)揮作用。

GFP-LC3-RFP全基因組篩選思路

TMEM41B敲除對自噬的影響

Genome-wide CRISPR screen identifies TMEM41B as a gene required for autophagosome formation. J Cell Biol. 2018; 217(11):3817-3828.

3）肺轉(zhuǎn)移基因篩選

Cell雜志發(fā)表的張峰團隊的研究論文，該研究采用“全基因組CRISPR敲除文庫”，經(jīng)過慢病毒庫擴增后，感染肺癌細胞株，經(jīng)篩選后接種到裸鼠皮下，定期觀察直至其肺部生成足量轉(zhuǎn)移灶，取肺組織并提取基因組，PCR產(chǎn)物進行高通量測序獲得肺轉(zhuǎn)移相關基因，并進行實驗驗證。

篩選思路

腫瘤生長及轉(zhuǎn)移情況

原發(fā)性腫瘤基因富集分析       轉(zhuǎn)移瘤基因富集分析

單基因體內(nèi)驗證

Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 2015; 160(6):1246-60.

 

4）免疫相關基因篩選

哈佛大學醫(yī)學院Dana-Farber癌癥研究所等研究團隊通過CRISPR文庫體內(nèi)篩選，鑒定出免疫相關基因Ptpn2，抑制Ptpn2可能會增強引起IFNγ反應的免疫療法的效果，Ptpn2有望作為新的免疫治療靶標。  

篩選策略

體內(nèi)實驗驗證篩選到靶標Ptpn2

Ptpn2缺失使腫瘤對免疫療法敏感

In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 2017; 547(7664):413-418.


其他相關文獻

A CRISPR screen identifies CDK7 as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma. Cell Res. 2018.

Genome-wide CRISPR screen for PARKIN regulators reveals transcriptionalrepression as a determinant of mitophagy. Proc Natl Acad Sci. 2018.

An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance.Cell.2018.

Defining essential genes for human pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 screening in haploid cells. Nat Cell Biol. 2018.

TRRAP is essential for regulating the accumulation of mutant and wild-type p53 in lymphoma. Blood. 2018.

LKB1, Salt-Inducible Kinases, and MEF2C Are Linked Dependencies in Acute Myeloid Leukemia .Mol Cell. 2018.

Genome-wide?CRISPR-Cas9?Screen?Identifies Leukemia-Specific Dependence on a Pre-mRNA Metabolic Pathway Regulated by DCPS. Cancer Cell. 2018.

CRISPR-Cas9 screen reveals a MYCN-amplified neuroblastoma dependency on EZH2. J Clin Invest. 2018.

Genome-scale CRISPR-Cas9 Knockout and Transcriptional Activation Screening. Nature Protocols, 2017.

Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood. Nature, 2017.

Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. Elife, 2016.

Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature biotechnology, 2016

A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks. Cell, 2015 

High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell, 2015 

Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science, 2015.

Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature biotechnology, 2015

Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015.

High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature, 2014

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