|
>
/ /
CRISPR/Cas9系統(tǒng)是當今基因編輯領域最熱門的明星工具,2013年,Broad研究所的兩個研究團隊分別在Science雜志同一期上發(fā)表了CRISPR文庫的相關研究。在此之后,基于CRISPR/Cas9的工具得到了快速發(fā)展,CRISPRa,CRISPRi及CRISPR敲除文庫已經(jīng)廣泛用于證明新的生物學機制,如耐藥性和細胞存活信號。多篇CNS(Cell、Nature、Science)連續(xù)報道。利用該技術(shù),研究人員在藥物靶標發(fā)現(xiàn)、基因功能研究、藥物敏感基因研究等領域取得了巨大的成功。
1、服務內(nèi)容(以耐藥基因為例)
1)臨床問題提出,選定合適的研究目標,確定研究癌種與目標藥物。
2)個性化設計,全基因組篩選可能與藥物發(fā)揮拮抗作用的基因。
3)高通量測序及候選基因篩選
4)候選基因功能驗證:細胞水平、動物水平,臨床相關性等
5)數(shù)據(jù)庫檢索尋找候選增敏基因的小分子抑制劑,如有可進行成藥性研究,驗證藥物協(xié)同作用。
2、一般篩選流程(耐藥基因為例)
3、篩選優(yōu)點
快速準確的找到與某種表型相關的基因
靶點效率高
應用范圍廣
開發(fā)潛力大
4、現(xiàn)有CRISPR篩選文庫
1、靶向激活10,504個lncRNA
2、包含96,458個sgRNA靶點
1、靶向敲除19,050個mRNA 及1864個miRNA
2、包含123,411個sgRNA靶點
1、靶向激活23,430個mRNA
2、包含70,290個sgRNA靶點
1、靶向敲除20,611個mRNA 及1175個miRNA
2、包含130,209個sgRNA靶點
1、靶向激活22,774 (Set A), 22,658 (Set B) 個mRNA
2、包含134,076個sgRNA靶點
其他個性化定制 CRISPR/cas9 慢病毒文庫5、篩選案例
1)藥物靶標發(fā)現(xiàn)
Molecular Cancer(If 7.776)雜志8月份在線發(fā)表了廣州市第一人民醫(yī)院的文章,伊馬替尼是一種治療白血病及胃腸道間質(zhì)腫瘤的藥物,但往往產(chǎn)生耐藥,機制不明。在該研究中,研究人員運用CRISPR/Cas9全基因敲除文庫在胃間質(zhì)瘤中篩選并驗證了9個可能參與伊馬替尼耐藥的基因,可以用于深入探討伊馬替尼耐藥的分子機制。
“篩選”耐藥基因的思路
耐藥基因篩選、差異基因的通路富集分析
耐藥基因功能驗證
Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in gastrointestinal stromal tumor
with Imatinib resistance. Molecular Cancer. 2018; 17(1):121-127.
2018年4月份哈佛大學研究團隊在Cell雜志發(fā)表了運用CRISPR激活文庫篩選了化療耐藥相關的lncRNAs的研究論文。阿糖胞苷(Cytarabine, Ara-C)是一種治療AML的藥物,但往往產(chǎn)生耐藥,機制不明。作者利用CRISPR文庫原理構(gòu)建了同時篩選有功能的mRNA、lncRNA的sgRNA篩選技術(shù),通過“隨機激活lncRNA、mRNA的轉(zhuǎn)錄表達”的方式,篩選針對AML的阿糖胞苷耐藥RNA。最后發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS6-AS2的激活會介導耐藥的產(chǎn)生,并通過體內(nèi)、外實驗驗證這一發(fā)現(xiàn)。
技術(shù)路線
耐藥基因篩選策略、差異基因的通路富集分析
富集lncRNA的關聯(lián)通路注釋
GAS6-AS2耐藥:體外功能驗證,預后分析
GAS6-AS2耐藥:體內(nèi)驗證
An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance. Cell. 2018; 173(3):649-664.e20.
2)自噬相關基因篩選
自噬是一種細胞內(nèi)降解過程,需要多個自噬相關(ATG)基因的參與。在這個研究中,東京國立癌癥中心研究所采用自噬流體報告基因GFP-LC3-RFP進行了全基因組CRISPR文庫篩選,并鑒定出新的ATG家族基因TMEM41B,并發(fā)現(xiàn)TMEM41B與VMP1在自噬體形成的早期階段一起發(fā)揮作用。
GFP-LC3-RFP全基因組篩選思路
TMEM41B敲除對自噬的影響
Genome-wide CRISPR screen identifies TMEM41B as a gene required for autophagosome formation. J Cell Biol. 2018; 217(11):3817-3828.
3)肺轉(zhuǎn)移基因篩選
Cell雜志發(fā)表的張峰團隊的研究論文,該研究采用“全基因組CRISPR敲除文庫”,經(jīng)過慢病毒庫擴增后,感染肺癌細胞株,經(jīng)篩選后接種到裸鼠皮下,定期觀察直至其肺部生成足量轉(zhuǎn)移灶,取肺組織并提取基因組,PCR產(chǎn)物進行高通量測序獲得肺轉(zhuǎn)移相關基因,并進行實驗驗證。
篩選思路
腫瘤生長及轉(zhuǎn)移情況
原發(fā)性腫瘤基因富集分析 轉(zhuǎn)移瘤基因富集分析
單基因體內(nèi)驗證
Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 2015; 160(6):1246-60.
4)免疫相關基因篩選
哈佛大學醫(yī)學院Dana-Farber癌癥研究所等研究團隊通過CRISPR文庫體內(nèi)篩選,鑒定出免疫相關基因Ptpn2,抑制Ptpn2可能會增強引起IFNγ反應的免疫療法的效果,Ptpn2有望作為新的免疫治療靶標。
篩選策略
體內(nèi)實驗驗證篩選到靶標Ptpn2
Ptpn2缺失使腫瘤對免疫療法敏感
In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 2017; 547(7664):413-418.
其他相關文獻
A CRISPR screen identifies CDK7 as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma. Cell Res. 2018.
Genome-wide CRISPR screen for PARKIN regulators reveals transcriptionalrepression as a determinant of mitophagy. Proc Natl Acad Sci. 2018.
An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance.Cell.2018.
Defining essential genes for human pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 screening in haploid cells. Nat Cell Biol. 2018.
TRRAP is essential for regulating the accumulation of mutant and wild-type p53 in lymphoma. Blood. 2018.
LKB1, Salt-Inducible Kinases, and MEF2C Are Linked Dependencies in Acute Myeloid Leukemia .Mol Cell. 2018.
Genome-wide?CRISPR-Cas9?Screen?Identifies Leukemia-Specific Dependence on a Pre-mRNA Metabolic Pathway Regulated by DCPS. Cancer Cell. 2018.
CRISPR-Cas9 screen reveals a MYCN-amplified neuroblastoma dependency on EZH2. J Clin Invest. 2018.
Genome-scale CRISPR-Cas9 Knockout and Transcriptional Activation Screening. Nature Protocols, 2017.
Genome-scale activation screen identifies a lncRNA locus regulating a gene neighbourhood. Nature, 2017.
Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. Elife, 2016.
Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9. Nature biotechnology, 2016
A genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks. Cell, 2015
High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell, 2015
Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science, 2015.
Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature biotechnology, 2015
Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, 2015.
High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature, 2014
CRISPR/Cas9文庫功能基因篩選整體解決方案,CRISPR/Cas9文庫功能基因篩選整體解決方案
/CRISPR/Cas9文庫功能基因篩選整體解決方案信息由廣州輝園苑醫(yī)藥科技有限公司為您提供,如您想了解更多關于CRISPR/Cas9文庫功能基因篩選整體解決方案報價、型號、參數(shù)等信息,歡迎來電或留言咨詢。
/注:該產(chǎn)品未在中華人民共和國食品藥品監(jiān)督管理部門申請醫(yī)療器械注冊和備案,不可用于臨床診斷或治療等相關用途