一、 實(shí)驗原理：
真核生物基因的轉(zhuǎn)錄起始需轉(zhuǎn)錄因子參與，轉(zhuǎn)錄因子通常由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA—binding domain，BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain，AD)。用于酵母單雜交系統(tǒng)的酵母GAL4蛋白是一種典型的轉(zhuǎn)錄因子，GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域靠近羧基端，含有幾個鋅指結(jié)構(gòu)，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位點(diǎn)(UAS)，而轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可與RNA聚合酶或轉(zhuǎn)錄因子TFIID相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在這一過程中，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可完全獨(dú)立地發(fā)揮作用。在GAL4系統(tǒng)中構(gòu)建與基因的ORFs融合的激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，順式作用元件與GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD融合構(gòu)建載體，分別轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若與順式作用元件發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性?；蜣D(zhuǎn)錄實(shí)際上是轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子和啟動子區(qū)各種順式作用元件相互作用的結(jié)果，這種結(jié)合猶如蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的互作一樣具有特異性，這是研究順式作用元件即 DNA 序列與蛋白質(zhì)互作的基礎(chǔ)。酵母單雙雜交（點(diǎn)對點(diǎn)），最終結(jié)果是確定候選的DNA-蛋白質(zhì)是否存在相互作用。

二、實(shí)驗步驟
1. 準(zhǔn)備酵母感受態(tài)細(xì)胞（LiAc Method）。
2. pGADT7和pHIS2共轉(zhuǎn)化酵母菌株Y187，涂二缺平板，28度恒溫箱培養(yǎng)。
3. 挑取二缺平板克隆至三缺（含不同濃度3-AT），28度恒溫箱培養(yǎng)。

三、實(shí)驗結(jié)果：
1. 二缺和三缺平板原始圖片拍照。
2. 原始圖片整理圖版。


一、 實(shí)驗原理：
酵母雙雜交系統(tǒng)是在酵母體內(nèi)通過重建有活性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)來鑒定蛋白質(zhì)之間的相互作用。轉(zhuǎn)錄因子可以和DNA上特異的序列結(jié)合而啟動相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這種DNA結(jié)合與轉(zhuǎn)錄激活的功能是由轉(zhuǎn)錄因子上兩個相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域即DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Binding Domain, BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(Activation Domain, AD)分別來完成的，并且這兩個結(jié)構(gòu)域?qū)τ诨虻霓D(zhuǎn)錄激活都是必須的。在GAL4系統(tǒng)中利用轉(zhuǎn)錄因子GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域GAL4-BD與激活結(jié)構(gòu)域GAL4-AD的特異載體，分別與基因的ORFs融合，轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞。在酵母內(nèi)表達(dá)的蛋白若發(fā)生相互作用時，就會將GAL4-BD和GAL4-AD結(jié)合在一起，從而與上游激活序列(upstream activating sequence, UAS)結(jié)合，激活相應(yīng)報告基因的表達(dá)，在相應(yīng)的營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上篩選陽性。酵母雙雜交（點(diǎn)對點(diǎn)），最終結(jié)果是確定候選的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)是否存在相互作用。

二、實(shí)驗步驟
1. 準(zhǔn)備酵母感受態(tài)細(xì)胞（LiAc Method）。
2. pGADT7和pGBKT7共轉(zhuǎn)化酵母菌株AH109，涂二缺平板（含自激活和毒性檢測），28度恒溫箱培養(yǎng)。
3. 挑取二缺平板克隆至四缺，四缺（含x-a-gal），28度恒溫箱培養(yǎng)。

三、實(shí)驗結(jié)果：
1. 二缺和四缺平板原始圖片拍照。
2. 原始圖片整理圖版。

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