環(huán)狀RNA（circular RNA）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類特殊的非編碼RNA，它大量存在于真核細胞胞質(zhì)內(nèi)，是mRNA在剪接的過程中，上游exon的5’端與下游exon的3’端剪接到一起，從而形成的首尾相接的環(huán)狀分子。
       研究發(fā)現(xiàn)，高等動物中circRNA的種類和含量遠遠超過預(yù)期。circRNA具有很多重要的調(diào)控功能，如circRNA可以作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）結(jié)合胞內(nèi)miRNA，阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用。除此以外，circRNA也具有調(diào)控其他類型RNA、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性等功能。circRNA在不同物種中具有保守性和組織表達特異性，且circRNA對RNase不敏感，因此它比線性RNA更為穩(wěn)定，所以circRNA在疾病新型診斷與治療方法研發(fā)方面有巨大潛力和重要意義。

1、實驗方案
       測序平臺和方式：Illumina 平臺   PE150
      數(shù)據(jù)量：12G clean data/樣

2、技術(shù)優(yōu)勢
（1）多物種選擇：可直接對人、大鼠和小鼠樣本進行最全面的circRNA分析，亦可發(fā)現(xiàn)新的circRNA（其他物種需特殊評估）；
（2）高精確度：數(shù)字化信號，可預(yù)測到基因家族中相似基因以及不同可變剪切類型產(chǎn)生的circRNA序列信息；
（3）高覆蓋度：新一代高通量測序技術(shù)的高深度覆蓋，可以檢測到低豐度的稀有circRNA。
   
3、數(shù)據(jù)分析
（1）測序質(zhì)量評估：
              原始數(shù)據(jù)過濾統(tǒng)計
              Clean數(shù)據(jù)堿基組成和質(zhì)量分布圖
（2）比對結(jié)果統(tǒng)計：
              比對數(shù)據(jù)Reads數(shù)分布統(tǒng)計
（3）circRNA鑒定：
              circRNA統(tǒng)計列表
              circRNA的長度分布
              circRNA的來源分布
              已知circRNA的注釋
（4）circRNA的表達水平及差異表達分析：
              circRNA的表達水平分析
              circRNA的差異表達結(jié)果
              兩兩樣本之間的差異表達
              樣本間共享和特有circRNA統(tǒng)計分析
（5）circRNA的來源基因分析：
              circRNA來源基因的GO富集分析
              circRNA來源基因的KEGG富集分析
（6）circRNA與miRNA的結(jié)合位點預(yù)測分析


4、技術(shù)流程


5、案例分析
       案例（1）環(huán)狀RNA促進結(jié)腸癌增殖和轉(zhuǎn)移
       研究者對正常組織和腫瘤結(jié)腸組織樣本進行了circRNA測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大量在腫瘤細胞中特異性升高的circRNA，其中一些circRNA得到了RT-PCR實驗結(jié)果的驗證。研究人員對其中一類新的circRNA——circCCDC66的功能進行了深入研究。結(jié)果表明circCCDC66在息肉和結(jié)腸癌中表達水平升高，并且與不良預(yù)后相關(guān)。通過在結(jié)直腸癌細胞系中進行功能獲得性研究和功能缺失性研究，研究人員證明circCCDC66能夠控制多個生理過程，包括細胞增殖、遷移、侵襲和非貼附性生長等。進一步的研究表明circCCDC66通過調(diào)節(jié)一系列癌基因來發(fā)揮它的功能，并且在異種移植腫瘤模型和原位模型中敲低circCCDC66的表達均能夠抑制腫瘤生長和侵襲。
       以上發(fā)現(xiàn)表明，環(huán)狀RNA在癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮癌基因功能。該研究為了解環(huán)狀RNA與癌癥之間的關(guān)系以及尋找新的癌癥治療手段提供了重要參考信息。 

圖1 circCCDC66促進結(jié)腸癌增殖

       案例（2）circHIPK3通過結(jié)合miRNA來調(diào)節(jié)細胞生長
       對6個正常組織和7個腫瘤組織測序，共鑒定出27296個circRNA分子，超過80%的環(huán)狀RNA分子起源于外顯子（exon）區(qū)。這些circRNA在正常組織和腫瘤組織中存在表達差異。進一步分析發(fā)現(xiàn)一個來源于2號外顯子HIPK3的circHIPK3，它存在18個結(jié)合位點能夠與9個miRNA結(jié)合，從而抑制細胞生長。

圖1 不同組織circRNA的表達差異
 

圖2 七個癌組織和對應(yīng)正常組織中鑒定的特異性circRNA的數(shù)目
 

圖3 circRNA表達豐度多維圖

參考文獻
[1] Hsiao et al. Noncoding Effects of Circular RNA CCDC66 Promote Colon Cancer Growth and Metastasis. Cancer Research, 2016.
[2] Zheng et al. Circular RNA profiling reveals an abundant circHIPK3 that regulates cell growth by sponging multiple miRNAs. Nature Communications, 2016.

CircRNA測序,CircRNA測序

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