T淋巴細(xì)胞（T cell）和B淋巴細(xì)胞（B cell）主要負(fù)責(zé)適應(yīng)性免疫應(yīng)答，其抗原識別主要依賴于T細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）和B細(xì)胞受體（B cell recptor, BCR），這兩類細(xì)胞表面分子的共同特點(diǎn)是其多樣性，可以識別多種多樣的抗原分子。BCR的重鏈和TCRβ鏈由V、D、J、C四個基因片段組成，BCR的輕鏈和TCRα鏈由V、J、C三個基因片段組成，這些基因片段在遺傳過程中發(fā)生重組、重排，組合成不同的形式，保證了受體多樣性。
傳統(tǒng)免疫組庫研究方式局限性較大，10xGenomics新推出的“單細(xì)胞免疫譜分析”利用其微流控芯片制備單細(xì)胞體系，選擇5'端接頭的通用引物和免疫分子恒定區(qū)的巢式引物進(jìn)行V(D)J富集，實現(xiàn)在單細(xì)胞水平，對成對的重鏈和輕鏈（B細(xì)胞）或α和β鏈（T細(xì)胞）進(jìn)行全長測序，為免疫組庫全面、系統(tǒng)的研究提供了高效的技術(shù)平臺，對疾病發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制研究有重要的意義。

圖1. 10xGenomics單細(xì)胞系統(tǒng)

1 技術(shù)原理

10xGenomic單細(xì)胞免疫組庫測序是建立在GemCode技術(shù)上的微流體平臺，將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個細(xì)胞包裹在油滴中；接下來在每個油滴內(nèi)，凝膠珠溶解，細(xì)胞裂解釋放mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生用于測序的帶條形碼的cDNA。液體油層破壞后，cDNA一分為二，后續(xù)同時進(jìn)行基因表達(dá)和免疫組庫文庫構(gòu)建；其中TCR或者BCR的V(D)J序列通過設(shè)計在TCR或者BCR的C區(qū)域的巢式PCR引物進(jìn)行富集。然后使用Illumina測序平臺對文庫進(jìn)行測序檢測，即可一次性獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)和免疫組庫數(shù)據(jù)，實現(xiàn)在單細(xì)胞水平同時對基因表達(dá)和免疫組庫進(jìn)行研究。

圖2 . V(D)J重組產(chǎn)生TCR、BCR多樣性

2 樣本要求

◆ 樣品類型：新鮮人或小鼠細(xì)胞懸液、血液（全血、PBMC等）；
◆ 細(xì)胞來源：血液提取、磁珠富集、流式分選、組織解離；
◆ 細(xì)胞大小：小于40um；
◆ 細(xì)胞總量：細(xì)胞懸液，一個樣本細(xì)胞起始量約1x105個。
◆ 質(zhì)量要求：細(xì)胞活性大于85%，理想濃度為1000個/ul(500~2000個/μl)。
◆ 細(xì)胞培養(yǎng)基及緩沖液不能含有Ca2+和Mg2+等影響酶活性的物質(zhì)。

3 實驗流程

利用10xGenomics平臺完成單細(xì)胞的分離、反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，選擇不同的研究目的進(jìn)行文庫構(gòu)建：5’基因表達(dá)文庫、TCR的V(D)J文庫或和BCR的V(D)J文庫。將cDNA分成2份或3份同時進(jìn)行TCR/BCR的V(D)J富集、文庫構(gòu)建、測序和5’單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建、測序，獲得每個細(xì)胞表達(dá)譜和V(D)J全長序列，獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)胞亞群聚類、細(xì)胞表達(dá)特征和標(biāo)記分子篩選等分析。

圖3.  5’單細(xì)胞表達(dá)譜和V(D)J免疫組庫實驗流程



圖4.  5’單細(xì)胞表達(dá)譜和V(D)J免疫組文庫的比較



表1.  5’單細(xì)胞表達(dá)譜和V(D)J免疫組文庫及測序參數(shù)

4 分析內(nèi)容

測序數(shù)據(jù)質(zhì)量控制；

比對與注釋：樣本基本信息結(jié)果統(tǒng)計，樣本contig注釋信息結(jié)果統(tǒng)計，樣本Consensus序列注釋信息結(jié)果統(tǒng)計；

Clonotype分型；

特征分析：CDR3特征分析，V/J基因特征分析，V-J Paired特征分析；

多樣本分析：樣本間Clonotype比較，Overlapping Clonotype聚類分析，Overlapping Clonotype差異分析。

5 技術(shù)優(yōu)勢

可實現(xiàn)配對的重鏈和輕鏈（B細(xì)胞）或α和β鏈（T細(xì)胞）的全長測序；

精確到單細(xì)胞水平，能獲得大量單細(xì)胞的免疫組數(shù)據(jù)；

大規(guī)模單細(xì)胞VDJ+表達(dá)譜測序，單個細(xì)胞成本大大降低；

同時獲得5’gene expression的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，可與免疫組數(shù)據(jù)聯(lián)合分析

6 案例分享

Single-Cell Map of Diverse Immune Phenotypes in the Breast Tumor Microenvironment
CELL影響因子: 30.41   Elham Azizi at el. 2018.

了解腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的表型，對于癌癥進(jìn)展和免疫治療反應(yīng)的研究至關(guān)重要。研究者使用單細(xì)胞RNA測序分析了來自8位原發(fā)性乳腺癌患者的45,000個免疫細(xì)胞，同時也添加了正常乳腺組織、血液和淋巴結(jié)中的免疫細(xì)胞作對照。研究者開發(fā)了預(yù)處理流程SEQC和貝葉斯聚類和歸一化方法Biscuit，用來解決單細(xì)胞數(shù)據(jù)固有的計算難題。研究中觀察到正常免疫細(xì)胞與腫瘤組織中免疫細(xì)胞之間有顯著相似性，但后者針對腫瘤微環(huán)境出現(xiàn)特異性連續(xù)表型擴(kuò)展。對來自另外27,000個T細(xì)胞的成對單細(xì)胞RNA和T細(xì)胞受體（TCR）測序，結(jié)果揭示了TCR組合使用對表型多樣性的影響。研究結(jié)果支持T細(xì)胞連續(xù)活化模型，但不符合癌癥中的巨噬細(xì)胞極化模型。本研究結(jié)果對表征腫瘤浸潤免疫細(xì)胞具有重要意義。

華銀健康高通量測序檢測中心
中心定位于科研服務(wù)與臨床醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化應(yīng)用，致力于生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的相關(guān)研究與測序大數(shù)據(jù)聯(lián)合分析，為各大高校、醫(yī)院和科研單位提供醫(yī)學(xué)科研項目的實驗設(shè)計、測序方案和數(shù)據(jù)分析為一體的一站式服務(wù)。形成以臨床應(yīng)用為導(dǎo)向的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，力爭為客戶提供專業(yè)、快速的臨床醫(yī)學(xué)檢測服務(wù)。
目前，華銀高通量檢測平臺擁有Illumina和Thermo Fisher等高通量測序儀組成的大規(guī)模高通量測序服務(wù)平臺，科研服務(wù)可提供涵蓋外泌體組學(xué)、免疫組學(xué)、基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、微生物組學(xué)、蛋白組學(xué)和代謝組學(xué)等各種測序服務(wù)和高級生物信息分析服務(wù)；臨床檢測服務(wù)包括遺傳性腎病全譜基因檢測、臨床病原微生物檢測、腫瘤分子病理檢測等服務(wù)。

10×單細(xì)胞免疫組庫測序,10×單細(xì)胞免疫組庫測序

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注：該產(chǎn)品未在中華人民共和國食品藥品監(jiān)督管理部門申請醫(yī)療器械注冊和備案，不可用于臨床診斷或治療等相關(guān)用途