RRBS服務(wù)簡介

       Reduced Representation Bisulfite Sequencing（RRBS）是一種準確、高效、經(jīng)濟的DNA甲基化研究方法，通過MspI酶識別CCGG酶切位點處理DNA，富集啟動子及CpG島區(qū)域，并進行 Bisulfite處理和高通量測序，同時實現(xiàn)DNA甲基化狀態(tài)檢測的高分辨率和測序數(shù)據(jù)的高利用率。DNA甲基化研究一直是疾病研究的熱點，與基因表達、表型性狀息息相關(guān)。 RRBS作為一種高性價比的甲基化研究方法，在大規(guī)模臨床樣本的研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

1、實驗方案
      測序策略：Illumina 平臺  PE150
      數(shù)據(jù)量：5G clean data

2、技術(shù)優(yōu)勢
（1）精確度高：在其覆蓋范圍內(nèi)可達到單堿基分辨率，見下表；
（2）重復(fù)性好：多樣本的覆蓋區(qū)域重復(fù)性高達85%-95%，適合多樣本間的甲基化差異分析；
（3）檢測范圍廣： 覆蓋全基因組范圍內(nèi)超過5百萬個CpG位點；
（4）性價比高：測序區(qū)域更有針對性，數(shù)據(jù)利用率更高。
 

表1 三種甲基化研究技術(shù)比較

甲基化研究方法Bisulfite-SeqRRBSMeDIP-Seq覆蓋范圍全基因組主要集中在CpG島和promoter區(qū)域全基因組范圍，但是傾向于高CpG密度和高甲基化區(qū)域原理Bisulfite處理酶切+Bisulfite處理抗體富集分辨率1bp1bp100-1000bp數(shù)據(jù)量≥30X 基因組3G、5G4G鑒定MDR的數(shù)量多多少DMRs的靈敏度高高低插入片段長度200-300 bp40-220 bp200-300 bp價格昂貴便宜便宜

 

3、數(shù)據(jù)分析
3.1 標準信息分析
（1）去接頭污染，去低質(zhì)量reads和產(chǎn)量情況統(tǒng)計； 
（2）RRBS序列與參考序列的比對； 
（3）Promoter和CGI（CpG island）覆蓋度分析；
（4）Promoter和CGI區(qū)的甲基化分析：
（5）甲基化C堿基中CG，CHG 與CHH 的分布比例；
（6）甲基化C的平均甲基化水平； 
（7）不同C堿基類型（CG,CHG,CHH）甲基化水平的分布； 
（8）區(qū)域甲基化圖譜；   
（9）差異甲基化區(qū)域（DMR）的分析。
3.2 高級信息分析
     根據(jù)客戶的具體研究進行的個性化分析

4、技術(shù)流程


5、案例分析
       案例（1）UHRF家族蛋白過表達導致腫瘤細胞DNA低甲基化
       細胞DNA低甲基化是腫瘤中最常見的表觀改變，但機理不明。研究表明UHRF1調(diào)停DNMT1甲基化后的DNA修復(fù)。通過RRBS技術(shù)，報道UHRF1和UFRF2可以行使E3連接酶功能，促進DNMT3A降解以阻止DNA甲基化的從頭合成過程。UHRF1/2通常在腫瘤中呈現(xiàn)過表達，研究表明UHRF1/2過表達抑制了DNMT3A蛋白合成進而導致DNA低甲基化。如果廢止對DNMT3A的下調(diào)作用或者促使DNMT3A的過表達，則會直接引起DNA甲基化并使得腫瘤生長受損。該研究提出一種工作模型：UHRF1/2守衛(wèi)DNA甲基化的保真度，通過UHRF1/2過表達抑制DNMT2A進而引起腫瘤中DNA低甲基化的一個因子。

 圖1 UHRF2通過負調(diào)控DNA甲基化的從頭合成進而抑制DNA甲基化
 

 圖2  腫瘤中UHRF1/2過表達與DNMT3A蛋白下調(diào)的關(guān)系分析

        案例（2）人中性粒細胞基因組DNA甲基化組和轉(zhuǎn)錄組譜
       DNA分子甲基化是一種與人類疾病、基因表達和表型變化相關(guān)的重要機理。利用RRBS技術(shù)，新西蘭研究人員分析出在健康個體中DNA的甲基化模式，同時識別了表現(xiàn)出顯著個體化差異的基因。研究人員使用illumina GAII和Hiseq2000平臺對13個樣本進行RRBS測序，共得到633 M條100bp讀長的數(shù)據(jù)。進一步使用illumina HiSeq2000平臺對其中四個樣本進行RNA-Seq，獲得174M 條51bp讀長的高質(zhì)量數(shù)據(jù)。目前的數(shù)據(jù)集合可以為一個綜合資源利用，以了解在健康個體中表型性狀、DNA甲基化導致的疾病易感性以及基因表達模式的本質(zhì)和機理。

圖1 RRBS測序reads的特征和質(zhì)量

參考文獻
[1] Jia et al. Negative regulation of DNMT3A de novo DNA methylation by frequently overexpressed UHRF family proteins as a mechanism for widespread DNA hypomethylation in cancer.Cell Discovery, 2016.
[2] Chatterjee et al. Genome-scale DNA methylome and transcriptome profiling of human neutrophils. Scientific Data, 2016.

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