宏基因組測序 服務(wù)介紹

       宏基因組測序是對特定環(huán)境樣品中的微生物群落基因組進(jìn)行高通量測序，以分析微生物群體基因組成多樣性與豐度，探求微生物與環(huán)境、微生物與宿主之間的關(guān)系，發(fā)掘和研究新的、具有特定功能的基因。宏基因組測序與傳統(tǒng)方法相比，無需進(jìn)行微生物分離培養(yǎng)，縮短了實驗周期，并且在鑒定腸道、唾液、糞便、生殖道等醫(yī)學(xué)樣品中低豐度的微生物群落中更有優(yōu)勢，可以進(jìn)行微生物群體的物種分類、群落結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、基因功能分析以及物種間的代謝網(wǎng)絡(luò)等分析。

1、實驗方案
      測序平臺與方式：Illumina平臺  PE150
      數(shù)據(jù)量：大于6G clean data

2、技術(shù)優(yōu)勢
（1）高通量：單次測序產(chǎn)生至少6G數(shù)據(jù)量，有利于發(fā)現(xiàn)特異物種信息，深度挖掘基因資源。
（2）快速高效：無需分離培養(yǎng)微生物，對微生物群落多樣性和功能基因等宏觀特征進(jìn)行研究，能更有效、準(zhǔn)確的反應(yīng)出微生物的真實狀態(tài)。
（3）信息全面：發(fā)現(xiàn)高豐度的物種，還能發(fā)現(xiàn)低豐度物種信息，構(gòu)建不同物種之間協(xié)同的代謝網(wǎng)絡(luò)。

3、數(shù)據(jù)分析
3.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控
3.2 Metagenome 組裝
3.3  基因預(yù)測
3.4  物種注釋
3.5  功能注釋
3.6  物種和功能分析
3.7 抗性基因分析：獲得抗性基因豐度分布情況以及這些抗性基因的物種歸屬和抗性機制
3.8 其他高級分析：如 CCA/RDA 分析，腸型分析，拷貝數(shù)變異（CNV）分析，CAG/MLG分析，病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫(PHI)注釋，分泌蛋白預(yù)測，III型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白預(yù)測，細(xì)菌致病菌毒力因子(VFDB)注釋，轉(zhuǎn)移元件分析（MGE）等；同時，結(jié)合環(huán)境因子、病理指標(biāo)或特殊表型進(jìn)行深入關(guān)聯(lián)研究，能夠
為進(jìn)一步深入研究和利用樣品的物種和功能提供理論依據(jù)。


4、技術(shù)流程 


宏基因組測序 案例分析  

       案例（1）宏基因組測序展示中國米酒中微生物組成和品質(zhì)的關(guān)系
       中國米酒（CRW）是中國一種常見的酒精飲料。為調(diào)查研究微生物組成對于CRW的質(zhì)量的影響，浙江大學(xué)研究人員使用高通量測序?qū)?10個米酒樣本進(jìn)行16s rDNA測序和真菌的ITS2進(jìn)行測序。生物信息分析得出，米酒變質(zhì)是由乳酸菌屬的比例過高導(dǎo)致，這也證實了酵母引子和最終米酒的質(zhì)量與微生物的分類組成相關(guān)。隨后，基于早期階段乳酸菌的含量，研究人員建立起一個模型來預(yù)測最后米酒的質(zhì)量。此外，從110個米酒樣本中挑選出20例有代表性的樣本，進(jìn)一步進(jìn)行宏基因組測序分析。結(jié)果顯示，米酒變質(zhì)是由乳酸菌在發(fā)酵早期的快速生長導(dǎo)致的?；蚬δ芊治鲲@示了一些信號通路的重要性比如生物素的合成，乳酸發(fā)酵和短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。最終結(jié)論為：微生物的新陳代謝影響米酒的質(zhì)量。因此，有益微生物的培養(yǎng)和干擾菌的抑制對于機械化釀酒同樣重要。

圖1 質(zhì)量好的米酒和質(zhì)量差的米酒的細(xì)菌和真菌的種群水平分布


 
圖2 宏基因組測序后的種群水平上的細(xì)菌與真菌組成分布圖
       案例（2）運用代謝組和宏基因組聯(lián)合分析與冠心病相關(guān)的血漿和尿液微生物
       冠心病（CHD）是當(dāng)今社會最高的健康威脅因素，然而目前還沒有真正可靠的早期診斷和預(yù)防冠心病的方法。所以研究冠心病的機理和異常生物標(biāo)記物的發(fā)展是迫切需要的。在本次研究中，代謝組學(xué)和宏基因組技術(shù)都被應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)新的血漿中和尿液中的生物標(biāo)記物，同時跟蹤其起源；本研究對象為59例CHD患者和43例健康對照者。本研究確定了GlcNAc-6-P，一種具有很好的診斷性同時可以用作潛在的CHD的生物標(biāo)記物，還有甘露醇和15種血漿膽堿。這些確定的代謝物顯示出與臨床生物化學(xué)指標(biāo)的顯著相關(guān)性。并且，GlcNAc-6-P和甘露醇是腸道微生物潛在的代謝產(chǎn)物。這些結(jié)果顯示在CHD患者中會發(fā)生代謝的顯著異常和腸道微生物失調(diào)。

圖1 CHD和對照樣本的主成分分析


       
 圖2 尿液中代謝物的斯皮爾曼相關(guān)分析
       案例（3）慢性牙周炎病人牙齦組織中的一種新型TTMV病毒
       本研究通過病毒宏基因組測序的方式在牙周炎患者的牙齦組織中檢測到一個新的微小病毒，并命名為TTMV-222。TTMV-222的2830-核酸基因組與TTMV1-CBD279的全部的62.6%的核酸組成十分相似。這個新的病毒的基因組的基因組序列分析顯示出一個傳統(tǒng)的基因序列組成方式但是與已知的序列比對不上。在牙周炎患者群體（n=150）中TTMV-222的普遍存在要明顯高于健康組人群（n=150）（p=0.032）中，提示著這種新病毒可能與慢性牙周炎患者的炎癥反應(yīng)相關(guān)。

圖1 TTMV-222病毒的基因組結(jié)構(gòu)圖    


         
圖2 鄰位相連法構(gòu)建的ORF1核酸系統(tǒng)發(fā)育樹

參考文獻(xiàn)
[1] Hong et al. Metagenomic sequencing reveals the relationship between microbiota composition and quality of Chinese Rice Wine. Scientific Reports, 2016.
[2] Feng et al. Integrated metabolomics and metagenomics analysis of plasma and urine identified microbial metabolites associated with coronary heart disease. Scientific Reports, 2016.
[3] Zhang et al. A novel species of torque teno mini virus (TTMV) in gingival tissue from chronic periodontitis patients. Scientific Reports, 2016.

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