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碧云天生產(chǎn)的線粒體膜電位與細胞凋亡檢測試劑盒(Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Detection Kit with Mito-Tracker Red CMXRos and Annexin V-FITC)是一種聯(lián)合使用線粒體膜電位依賴性的紅色熒光探針Mito-Tracker Red CMXRos(也稱MitoTracker Red CMXRos)和細胞凋亡綠色熒光探針Annexin V-FITC來檢測培養(yǎng)細胞的線粒體膜電位和細胞凋亡的紅綠熒光雙染試劑盒。紅色熒光標記的是保持線粒體膜電位的活細胞，而綠色熒光標記的是發(fā)生了凋亡或壞死的細胞。同時試劑盒還提供了用于細胞核熒光染色的Hoechst 33342染色液，便于在有需要的時候同時通過細胞核的碎裂和致密濃染等從形態(tài)學上觀察細胞凋亡。
本試劑盒使用便捷，結(jié)果清晰。本產(chǎn)品同時檢測線粒體膜電位變化和磷酯酰絲氨酸外翻兩個重要的凋亡檢測指標。本試劑盒檢測后，活細胞綠色熒光陰性，但紅色熒光陽性；而凋亡細胞綠色熒光陽性，同時紅色熒光顯著減弱或者呈現(xiàn)陰性，活細胞和死細胞的紅綠熒光對比非常鮮明(參見圖1)，可以使用熒光顯微鏡、流式細胞儀或其它熒光檢測設(shè)備進行檢測。需要指出的是，紅色熒光染色在誘導凋亡或壞死后會逐漸減弱，但部分紅色熒光減弱的細胞不一定綠色熒光染色陽性。需要指出的是，磷酯酰絲氨酸外翻是細胞凋亡的早期事件，在凋亡早期不一定會出現(xiàn)細胞核碎裂或致密濃染等細胞凋亡時細胞核的形態(tài)學變化。

圖1. 本試劑盒檢測正常細胞、凋亡細胞的效果。Vehicle組為正常培養(yǎng)的HT-29(人結(jié)腸癌細胞)細胞，細胞能被線粒體紅色熒光探針Mito-Tracker Red CMXRos染色，但Annexin V-FITC綠色熒光染色陰性；HT-29 (C6410)細胞經(jīng)過TNFα+SM-164 (TS)處理5小時后，一些凋亡的細胞綠色熒光呈現(xiàn)陽性，同時紅色熒光顯著減弱或者呈現(xiàn)陰性。圖中的藍色熒光為Hoechst 33342染色。TNFα+SM-164是一種細胞凋亡誘導試劑盒(C0006S)。實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器的不同而存在差異，本圖僅供參考。
細胞凋亡(Apoptosis)是生物體發(fā)育等生命過程中普遍存在的、由基因決定的細胞主動有序的死亡方式。當細胞遇到內(nèi)、外環(huán)境因子刺激時，啟動基因調(diào)控的自殺保護措施，去除體內(nèi)非必需細胞或即將發(fā)生特化的細胞。在這一過程中，細胞脫落離體或裂解為若干凋亡小體，并迅速被巨噬細胞或鄰近細胞清除，這是一種由基因控制、高度有序的細胞自主死亡，包含一系列信號事件組成的通路。細胞凋亡失調(diào)與多種疾病有關(guān)，例如阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)和癌癥等。
細胞凋亡通過特征性的形態(tài)學和生物化學變化而區(qū)別于壞死(Necrosis)，包括細胞皺縮、細胞核皺縮、核膜核仁破碎等等。在正常活細胞中，磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)位于細胞膜的近細胞質(zhì)面。而在凋亡細胞中，PS從質(zhì)膜的內(nèi)部外翻到細胞表面即細胞膜外側(cè)，從而使PS暴露于細胞外部。在白細胞的凋亡過程中，白細胞表面的PS標記可以被巨噬細胞識別，從而最終被巨噬細胞吞噬。人血管抗凝血劑Annexin V是一種35-36kDa Ca²⁺依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高親和力。用帶有綠色熒光的FITC標記的Annexin V (Annexin V-FITC)染色細胞，就可以通過熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀等熒光檢測設(shè)備非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細胞凋亡的重要特征。需要指出的是對于壞死細胞，由于細胞膜的完整性被破壞，位于細胞膜內(nèi)側(cè)的PS也會被Annexin V-FITC染色。
Mito-Tracker Red CMXRos (線粒體紅色熒光探針)是一種具有細胞通透性的X-rosamine衍生物(Chloromethyl-X-rosamine，簡稱CMXRos)，能夠特異性地標記細胞中具有生物活性的線粒體。對于正常細胞，Mito-Tracker Red CMXRos可以把其中的線粒體染色為明亮的紅色熒光，而當細胞發(fā)生凋亡等時，線粒體膜電位下降，此時線粒體的紅色熒光會逐漸減弱，甚至呈現(xiàn)紅色熒光陰性。
本試劑盒檢測的是Mito-Tracker Red CMXRos的紅色熒光和Annexin V-FITC的綠色熒光。同時本試劑盒提供Hoechst 33342，Hoechst 33342是一種具有細胞膜通透性的藍色熒光染料，對細胞的毒性較低，是一種優(yōu)秀的活細胞細胞核染料。Hoechst 33342、Annexin V-FITC和Mito-Tracker Red CMXRos的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜參考圖2。

圖2. Hoechst 33342、Annexin V-FITC和Mito-Tracker Red CMXRos的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。

本試劑盒小包裝C1071S可以檢測20個樣品，中包裝C1071M可以檢測50個樣品。
包裝清單：

保存條件：
-20℃保存，一年有效。Mito-Tracker Red CMXRos染色液、Annexin V-FITC和Hoechst 33342染色液需避光保存。
注意事項：
盡管經(jīng)測試Annexin V-FITC反復凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，但為取得良好的使用效果，3-6個月內(nèi)推薦4℃保存，并適當注意避免反復凍融。
如果細胞有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。
染色后宜盡快檢測，時間過長可能會導致凋亡或壞死細胞的數(shù)量增加。
如果細胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶可能會降解Annexin V-FITC，導致染色失敗。
熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
用于流式細胞儀檢測時，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC信號過強，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進行檢測。
需自備PBS或HBSS。
Mito-Tracker Red CMXRos染色液和Hoechst 33342染色液對人體有害，操作時請小心，并注意有效防護以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 對于懸浮細胞：
a. 在進行完細胞凋亡刺激后，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時也起到了洗滌細胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-FITC的結(jié)合。
b. 取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入188μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。
c. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。
d. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。
e. 如果用于流式細胞儀檢測，可立即上機檢測，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為綠色熒光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍色熒光(Ex/Em:350/461nm)，很多時候流式檢測僅檢測紅色和綠色熒光即可，也可以同時檢測紅綠藍三色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測；熒光探針的濃度可以根據(jù)具體的染色效果進行適當調(diào)整，以獲得更好的染色效果；熒光顯微鏡檢測或流式細胞儀檢測時，都可以不加入Hoechst 33342染色液。
2. 對于貼壁細胞的消化后檢測：
a. 把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶細胞消化液(可含有EDTA)消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細胞吹打下來時，吸除胰酶細胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
注意：對于貼壁細胞，胰酶消化步驟很關(guān)鍵。胰酶消化時間如果過短，細胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細胞膜的損傷；消化時間如果過長，同樣易造成細胞膜損傷，甚至會影響細胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合從而干擾對于細胞凋亡的檢測。同時，胰酶細胞消化液中應盡量不含EDTA，因為EDTA可能會影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。
b. 加入步驟2a中收集的細胞培養(yǎng)液，稍混勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細胞，用PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)。注意：加入步驟2a中的細胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞，另一方面細胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶；殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC導致染色失敗。
c. 取5-10萬重懸的細胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入188μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞。
d. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液、5μl Annexin V-FITC和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。
e. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。孵育過程中可以重懸細胞2-3次以改善染色效果。
f. 如果用于流式細胞儀檢測，可立即上機檢測，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光(Ex/Em:579/599nm)，Annexin V-FITC為綠色熒光(Ex/Em:492/520nm)，Hoechst 33342為藍色熒光(Ex/Em:350/461nm)，很多時候流式檢測僅檢測紅色和綠色熒光即可，也可以同時檢測紅綠藍三色熒光。如果用于熒光顯微鏡檢測，1000g離心5分鐘，收集細胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。
注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測；熒光探針的濃度可以根據(jù)具體的染色效果進行適當調(diào)整，以獲得更好的染色效果；熒光顯微鏡檢測或流式細胞儀檢測時，都可以不加入Hoechst 33342染色液。
3. 對于貼壁細胞的原位熒光檢測：
注：本方法的優(yōu)點是可以原位觀察細胞凋亡，缺點是部分凋亡由于不貼壁而檢測不到。
a. (選做)如果條件許可，把細胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導結(jié)束后，用可以對多孔板進行離心的離心機1000g離心5分鐘。
b. 吸除細胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。
c. 加入188μl Annexin V-FITC結(jié)合液。
d. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e. 加入2μl Mito-Tracker Red CMXRos染色液和5μl Hoechst 33342染色液，輕輕混勻。注意：Hoechst 33342染色液可以選擇性加入，不加入也是可以的。
f. 室溫(20-25℃)避光孵育20-30分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進行避光。
g. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Mito-Tracker Red CMXRos為紅色熒光，Annexin V-FITC為綠色熒光，Hoechst 33342為藍色熒光。
注意：細胞在染色后須盡快完成檢測，通常宜在1小時之內(nèi)完成檢測。熒光顯微鏡檢測時，也可以不加入Hoechst 33342染色液。

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