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Product Brief

• 產(chǎn)品概況

  產(chǎn)品貨號	MK1017
  產(chǎn)品名稱	TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒-AP（50T）
  保存條件	-20℃冷凍保存，一年有效。
  工作原理	在機體內(nèi)部隨時都在發(fā)生著細胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來觀察細胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點數(shù)目相同的3’-OH末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(Terminal deoxynucleotidyl Transferase )可以將地高辛標記的dUTP (DIG-dUTP)標記至3’-OH末端，DIG-dUTP結(jié)合在DNA斷點部位，可以通過生物素化抗地高辛抗體(Anti-DIG-Biotin)和SABC-AP反應(yīng)后，加入顯色底物BCIP/NBT予以顯示。凋亡的細胞核呈紫藍色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細胞。
  試劑盒內(nèi)容	1.標記緩沖液(Labeling Buffer)                       3ml 2.末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20)              50μl 3.DIG-dUTP(×20)                                          50μl 4.封閉液(Blocking Reagent)                          10ml 5.生物素化抗地高辛抗體(× 100)                     50μl 6.SABC-AP(×100)                                         50μl 7.Proteinase K (×200)                                  125μl 8.BCIP/NBT顯色劑(×20)                                0.5ml 9.抗體稀釋液                                                 10ml 10.陽性對照片2張

  
  

Instructions

用戶自備試劑

1. 多聚賴氨酸或APES(博士德公司有售)。
2. 0. 01M TBS(pH7.5)(配法:1L雙蒸餾水中加入8.5克氯化鈉,1.2克Tris 和0.45—0.5ml純
乙酸。)
3. 0.01M TBS,pH9.0-9.5(配法:1L雙蒸餾水中加入8.5克氯化鈉,1.2克Tris )。
4. 核固紅—復(fù)染用。
5. 水溶性封片劑。

操作步驟

1. 樣品處理
(1) 玻片預(yù)先用多聚賴氨酸或APES進行處理。
(2) 細胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0-7.6)室溫下固定30—60分鐘。PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌2分鐘×2次。
(3) 組織：應(yīng)及時固定。常規(guī)4%多聚甲醛/0.01M PBS(pH7.0-7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定4小時以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水9脫蠟務(wù)必干凈)。
2. 標本片加0. 01M TBS(pH7.5)1: 200新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化1-15分鐘, TBS洗2分鐘×3次。(細胞涂片和冰凍切片一般不消化或僅消化10-60秒鐘。新鮮石蠟切片消化5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化10-15分鐘)。
3. 標本片加標記緩沖液(Labeling Buffer),20μι/片,以保持切片濕潤。然后按每張切片取TdT和DIG-dUTP各1μι，加入18μι標記緩沖液中，混勻，甩去切片上多余液體后加混合的標記液，20μι/片。置樣品于濕盒中，37℃標記2小時。
4. 0. 01M TBS(pH7.5)洗2分鐘×3次。
5. 加封閉液50μι/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗。
6. 用抗體稀釋液1：100稀釋生物素化抗地高辛抗體：(取1ml抗體稀釋液加生物素化抗地高辛抗 體10μι)，混勻后50μι/片加至標本片上。置樣品于濕盒中，37℃反應(yīng)30-60分鐘。0.01M TBS洗2分鐘×3次。
7. 用抗體稀釋液1：100稀釋SABC-AP：取1ml抗體稀釋液加SABC-AP 10μι，混勻后50μι/片加至切片。37℃反應(yīng)60分鐘。0.01M TBS洗5分鐘×4次。
8. BCIP/NBT顯色：BCIP/NBT (×20)按1：20的比例用0.01M TBS (pH9.0-9.5)稀釋，混勻。顯色液加至標本上。避光顯色20-30分鐘，若無背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。充分水洗。
必要時可用核固紅等復(fù)染。水溶性封片劑(博士德有售)封片，也可簡單地用甘油封片。鏡檢。

結(jié)果判定

細胞核中有紫藍色顆粒者為陽性細胞，即凋亡的細胞。

注意事項

1.試劑盒嚴格-20℃存放。
2.初用時如試管底部無可見的試劑，在離心機離心3分鐘，使試劑沉至管底。
3.檢測過程中切勿使樣品干涸。
4.BCIP/NBT顯色較慢，可適當延長顯色時間。