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碧云天生產的細胞自噬與細胞毒性染色檢測試劑盒(MDC/PI法)，即Autophagy Staining Assay Kit with MDC and PI，是一種使用丹酰尸胺，也稱單丹磺酰尸胺、丹酰尸胺或丹酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)和碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)作為熒光探針快速便捷地檢測細胞自噬和細胞毒性的試劑盒。

自噬(autophagy)是一種在進化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細胞內分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關，在饑餓等環(huán)境條件下，細胞通過自噬降解多余或異常的細胞內組分，為細胞的生存提供能量及原材料，促進生物體的生長發(fā)育、細胞分化及對環(huán)境變化產生應答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關系。由于細胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經成為細胞生物學領域的一個研究熱點。

MDC是細胞自噬檢測最常用的熒光探針之一。MDC可以通過離子捕獲(ion trapping)和與膜脂的特異性結合，從而特異性標記自噬體(autophagosome)，也稱autophagic vacuole，因而常用于細胞自噬的檢測。MDC是一種嗜酸性熒光探針，很多酸性膜性結構也會被MDC染色，因此MDC染色時正常的細胞也會有一定的染色背景。

本產品的染色原理決定了本產品只能用于培養(yǎng)的細胞或者組織的細胞自噬熒光染色檢測，不能用于凍存的或固定的細胞、組織或者組織切片的染色檢測。

本試劑盒還提供了碘化丙啶染色液，可以同時進行細胞毒性的檢測。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)可以染色壞死細胞或凋亡晚期喪失細胞膜完整性的細胞，呈現紅色熒光。壞死細胞，自噬染色可能呈現陽性，也可能呈現陰性，都是合理的情況。

使用本產品染色后可以通過熒光顯微鏡拍照觀察，也可以通過熒光酶標儀或流式細胞儀進行熒光檢測。熒光顯微鏡觀察時MDC染色可以使用紫外區(qū)激發(fā)光激發(fā)，發(fā)出綠色熒光；熒光酶標儀或流式細胞儀推薦的激發(fā)波長為335nm (330-360nm均可)，發(fā)射波長為512nm (510-540nm均可)。PI和DNA形成復合物后，最大激發(fā)光波長為535nm，最大發(fā)射光波長為617nm，呈現熒光。

本產品用于細胞自噬和細胞毒性染色的效果參考圖1。

圖1.細胞自噬與細胞毒性染色檢測試劑盒(MDC/PI法)的染色效果圖。NRK-52E細胞用碧云天生產的C0213 Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)處理2h后，使用本試劑盒進行熒光染色，并在熒光顯微鏡下觀察染色效果。圖中EBSS處理后出現的綠色熒光亮點即為自噬的特征性變化。由于圖中未出現細胞壞死，因此圖中細胞的PI染色均呈現陰性。本圖僅供參考，實際檢測效果可能會因為實驗條件的不同而有所差異。

本產品如果用于6孔板或96孔板的檢測，小包裝分別可以檢測50或500個孔，中包裝分別可以檢測200或2000個孔。

包裝清單：  
   

保存條件：  
   

-20℃保存，一年有效。其中MDC (1000X)和PI (1000X)需要避光保存。Assay Buffer (10X)可以4℃保存，至少6個月有效。

注意事項：  
   

熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。MDC對光照特別敏感，操作過程中請盡量注意避光。

MDC (1000X)對人體有害，請注意適當防護。

本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：    
    1.試劑盒的準備。    
a.根據待檢測樣品的數量，取適量Assay Buffer (10X)用水稀釋10倍成為Assay Buffer (1X)，后續(xù)稱為Assay Buffer。整個檢測過程中96、48、24、12、6孔板每孔所需的Assay Buffer的用量約為0.5、0.75、1.25、2.5和5ml。    
b.根據待檢測樣品的數量，取適量MDC (1000X)和PI (1000X)，均按照1:1000的比例用Assay Buffer稀釋為MDC/PI (1X)，后續(xù)稱為MDC/PI染色液。96、48、24、12、6孔板每孔推薦使用的MDC/PI染色液用量為100、150、250、500和1000μl。涉及MDC和PI操作的時候，均需盡量注意避光操作。    
    2.貼壁細胞的自噬檢測(后續(xù)以6孔板為例，其它孔板檢測試劑的用量參考6孔板的用量和步驟1中的推薦用量進行適當調整)。    
a.經適當處理誘導自噬的細胞和未經誘導自噬的對照細胞，吸凈培養(yǎng)液。如果希望誘導自噬，通常吸除正常的完全培養(yǎng)液后，用PBS洗滌1次，然后加入Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)，在細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育1-4小時，就可以誘導細胞自噬發(fā)生。    C0213 Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)可以從碧云天訂購。    
b.每孔加入1ml MDC/PI染色液，在細胞培養(yǎng)箱中37℃避光孵育30min。孵育時間可以根據實際染色效果在10-60分鐘范圍內適當調整。    
c.吸凈MDC/PI染色液，使用Assay Buffer洗滌3次，每次使用0.8-1ml Assay Buffer。    
d.吸凈Assay Buffer，再加入1ml Assay Buffer。    
e.在熒光顯微鏡下用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察綠色熒光。或者使用熒光酶標儀進行熒光檢測，推薦的激發(fā)波長為335nm (330-360nm均可)，發(fā)射波長為512nm (510-540nm均可)。熒光顯微鏡下的檢測效果參考圖1。    
    3.懸浮細胞的自噬檢測。    
a.經適當處理誘導自噬的細胞和未經誘導自噬的對照細胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清。如果希望誘導自噬，通常離心吸除正常的完全培養(yǎng)液后，用PBS洗滌1次，然后加入Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)，在細胞培養(yǎng)箱中37℃孵育1-4小時，就可以誘導細胞自噬發(fā)生。    C0213 Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)可以從碧云天訂購。    
b.每50-100萬細胞加入1ml MDC/PI染色液，輕柔重懸并分散細胞，在細胞培養(yǎng)箱中37℃避光孵育30min。孵育時間可以根據實際染色效果在10-60分鐘范圍內適當調整。    
c.250-1000×g室溫離心5min，吸凈MDC/PI染色液。使用Assay Buffer洗滌3次，每次使用0.8-1ml Assay Buffer。    
d.吸凈Assay Buffer，后續(xù)用于細胞涂片檢測，或者加入適量Assay Buffer后用于酶標儀或流式細胞儀檢測。    
e.對于細胞涂片，在熒光顯微鏡下用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察綠色熒光。如果使用熒光酶標儀或流式細胞儀進行熒光檢測，推薦的激發(fā)波長為335nm (330-360nm均可)，發(fā)射波長為512nm (510-540nm均可)。    
    常見問題：    
1.染色后，大量貼壁細胞脫落。誘導自噬后，細胞生長狀態(tài)會變差，會比較容易從培養(yǎng)板表面脫落。對于貼壁比較弱的細胞，考慮使用多聚賴氨酸、鼠尾膠原或明膠等預處理細胞培養(yǎng)板，然后再進行細胞培養(yǎng)。    
2.染色過強或過弱。染色過強的情況，可以考慮縮短染色時間；染色過弱的情況，可以考慮適當延長染色時間。染色過弱，也有可能由于MDC/PI染色液使用時間較長或光照等原因發(fā)生淬滅，從而導致使用效果下降，此時需要購買新的試劑盒。    
3.陰性對照染色比較強。確保在MDC/PI染色后，至少洗滌3次，或洗滌更多次數，以確保陰性對照的染色比較弱。    
4.沒有觀察到預期的熒光。請核對并確保激發(fā)光正確，請核對操作步驟是否完全正確，以及陽性對照的設置是否正確和適當。    
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