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碧云天生產(chǎn)的細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)，即Autophagy Staining Assay Kit with MDC，是一種使用丹酰尸胺，也稱單丹磺酰尸胺、丹酰尸胺或丹酰戊二胺(monodansylcadaverine, MDC)作為熒光探針快速便捷地檢測(cè)細(xì)胞自噬的試劑盒。

自噬(autophagy)是一種在進(jìn)化上高度保守的通過溶酶體吞噬并降解部分自身組分的細(xì)胞內(nèi)分解代謝途徑。自噬與多種生理功能有關(guān)，在饑餓等環(huán)境條件下，細(xì)胞通過自噬降解多余或異常的細(xì)胞內(nèi)組分，為細(xì)胞的生存提供能量及原材料，促進(jìn)生物體的生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞分化及對(duì)環(huán)境變化產(chǎn)生應(yīng)答。自噬異常與多種病理過程如腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、代謝疾病、病原體感染等都有密切關(guān)系。由于細(xì)胞自噬在生理和病理過程中都有重要作用，自噬已經(jīng)成為細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

MDC是細(xì)胞自噬檢測(cè)最常用的熒光探針之一。MDC可以通過離子捕獲(ion trapping)和與膜脂的特異性結(jié)合，從而特異性標(biāo)記自噬體(autophagosome)，也稱autophagic vacuole，因而常用于細(xì)胞自噬的檢測(cè)。MDC是一種嗜酸性熒光探針，很多酸性膜性結(jié)構(gòu)也會(huì)被MDC染色，因此MDC染色時(shí)正常的細(xì)胞也會(huì)有一定的染色背景。

本產(chǎn)品的染色原理決定了本產(chǎn)品只能用于培養(yǎng)的細(xì)胞或者組織的細(xì)胞自噬熒光染色檢測(cè)，不能用于凍存的或固定的細(xì)胞、組織或者組織切片的染色檢測(cè)。

使用本產(chǎn)品染色后可以通過熒光顯微鏡拍照觀察，也可以通過熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)。熒光顯微鏡觀察時(shí)可以使用紫外區(qū)激發(fā)光激發(fā)，發(fā)出綠色熒光。熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀推薦的激發(fā)波長(zhǎng)為335nm (330-360nm均可)，發(fā)射波長(zhǎng)為512nm (510-540nm均可)。

本產(chǎn)品用于細(xì)胞自噬染色的效果參考圖1。

圖1.細(xì)胞自噬染色檢測(cè)試劑盒(MDC法)的染色效果圖。A549細(xì)胞用PBS或碧云天生產(chǎn)的C0213 Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)處理1h后，使用本試劑盒進(jìn)行熒光染色，最后使用紫外光激發(fā)后觀察綠色熒光。圖中PBS或EBSS處理后出現(xiàn)的綠色熒光亮點(diǎn)即為自噬的特征性變化。本圖僅供參考，實(shí)際檢測(cè)效果可能會(huì)因?yàn)閷?shí)驗(yàn)條件的不同而有所差異。

本產(chǎn)品如果用于6孔板或96孔板的檢測(cè)，小包裝分別可以檢測(cè)50或500個(gè)孔，中包裝分別可以檢測(cè)200或2000個(gè)孔。

包裝清單：  
   

保存條件：  
   

-20℃保存，一年有效。其中MDC (1000X)需要避光保存。Assay Buffer (10X)可以4℃保存，至少6個(gè)月有效。

注意事項(xiàng)：  
   

MDC對(duì)光照特別敏感，操作過程中請(qǐng)盡量注意避光。

MDC (1000X)對(duì)人體有害，請(qǐng)注意適當(dāng)防護(hù)。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：    
    1.試劑盒的準(zhǔn)備。    
a.根據(jù)待檢測(cè)樣品的數(shù)量，取適量Assay Buffer (10X)用水稀釋10倍成為Assay Buffer (1X)，后續(xù)稱為Assay Buffer。整個(gè)檢測(cè)過程中96、48、24、12、6孔板每孔所需的Assay Buffer的用量約為0.5、0.75、1.25、2.5和5ml。    
b.根據(jù)待檢測(cè)樣品的數(shù)量，取適量MDC (1000X)按照1:1000的比例用Assay Buffer稀釋為MDC (1X)，后續(xù)稱為MDC染色液。96、48、24、12、6孔板每孔推薦使用的MDC染色液用量為100、150、250、500和1000μl。涉及MDC操作的時(shí)候，均需盡量注意避光操作。    
    2.貼壁細(xì)胞的自噬檢測(cè)(后續(xù)以6孔板為例，其它孔板檢測(cè)試劑的用量參考6孔板的用量和步驟1中的推薦用量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整)。    
a.經(jīng)適當(dāng)處理誘導(dǎo)自噬的細(xì)胞和未經(jīng)誘導(dǎo)自噬的對(duì)照細(xì)胞，吸凈培養(yǎng)液。如果希望誘導(dǎo)自噬，通常吸除正常的完全培養(yǎng)液后，用PBS洗滌1次，然后加入Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育1-4小時(shí)，就可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。    C0213 Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)可以從碧云天訂購。    
b.每孔加入1ml MDC染色液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃避光孵育30min。孵育時(shí)間可以根據(jù)實(shí)際染色效果在10-60分鐘范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。    
c.吸凈MDC染色液，使用Assay Buffer洗滌3次，每次使用0.8-1ml Assay Buffer。    
d.吸凈Assay Buffer，再加入1ml Assay Buffer。    
e.在熒光顯微鏡下用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察綠色熒光?；蛘呤褂脽晒饷笜?biāo)儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，推薦的激發(fā)波長(zhǎng)為335nm (330-360nm均可)，發(fā)射波長(zhǎng)為512nm (510-540nm均可)。熒光顯微鏡下的檢測(cè)效果參考圖1。    
    3.懸浮細(xì)胞的自噬檢測(cè)。    
a.經(jīng)適當(dāng)處理誘導(dǎo)自噬的細(xì)胞和未經(jīng)誘導(dǎo)自噬的對(duì)照細(xì)胞，250-1000×g室溫離心5min，吸除上清。如果希望誘導(dǎo)自噬，通常離心吸除正常的完全培養(yǎng)液后，用PBS洗滌1次，然后加入Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育1-4小時(shí)，就可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。    C0213 Earle's Balanced Salt Solution (EBSS)可以從碧云天訂購。    
b.每50-100萬細(xì)胞加入1ml MDC染色液，輕柔重懸并分散細(xì)胞，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃避光孵育30min。孵育時(shí)間可以根據(jù)實(shí)際染色效果在10-60分鐘范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整。    
c.250-1000×g室溫離心5min，吸凈MDC染色液。使用Assay Buffer洗滌3次，每次使用0.8-1ml Assay Buffer。    
d.吸凈Assay Buffer，后續(xù)用于細(xì)胞涂片檢測(cè)，或者加入適量Assay Buffer后用于酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。    
e.對(duì)于細(xì)胞涂片，在熒光顯微鏡下用紫外激發(fā)光激發(fā)，觀察綠色熒光。如果使用熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光檢測(cè)，推薦的激發(fā)波長(zhǎng)為335nm (330-360nm均可)，發(fā)射波長(zhǎng)為512nm (510-540nm均可)。    
    常見問題：    
1.染色后，大量貼壁細(xì)胞脫落。誘導(dǎo)自噬后，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)會(huì)變差，會(huì)比較容易從培養(yǎng)板表面脫落。對(duì)于貼壁比較弱的細(xì)胞，考慮使用多聚賴氨酸、鼠尾膠原或明膠等預(yù)處理細(xì)胞培養(yǎng)板，然后再進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。    
2.染色過強(qiáng)或過弱。染色過強(qiáng)的情況，可以考慮縮短染色時(shí)間；染色過弱的情況，可以考慮適當(dāng)延長(zhǎng)染色時(shí)間。染色過弱，也有可能由于MDC染色液使用時(shí)間較長(zhǎng)或光照等原因發(fā)生淬滅，從而導(dǎo)致使用效果下降，此時(shí)需要購買新的試劑盒。    
3.陰性對(duì)照染色比較強(qiáng)。確保在MDC染色后，至少洗滌3次，或洗滌更多次數(shù)，以確保陰性對(duì)照的染色比較弱。    
4.沒有觀察到預(yù)期的熒光。請(qǐng)核對(duì)并確保激發(fā)光正確，請(qǐng)核對(duì)操作步驟是否完全正確，以及陽性對(duì)照的設(shè)置是否正確和適當(dāng)。    
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