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Product Brief

• 產(chǎn)品概況

  產(chǎn)品貨號(hào)	MK1014-100
  產(chǎn)品名稱	TUNEL細(xì)胞凋亡兩步法檢測(cè)試劑盒-AP（100T）
  保存條件	-20℃冷凍保存，一年有效。
  工作原理	在機(jī)體內(nèi)部隨時(shí)都在發(fā)生著細(xì)胞的死亡。傳統(tǒng)上用顯微鏡來(lái)觀察細(xì)胞的死亡，其特征為核染色質(zhì)的濃縮及碎片的形成。但是這種現(xiàn)象出現(xiàn)的很晚，時(shí)間也很短暫。凋亡的特征是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞自身的染色質(zhì)或DNA被切割，出現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口，并產(chǎn)生與DNA斷點(diǎn)數(shù)目相同的3’-OH末端。末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（Terminal deoxynucleotidyl Transferase）可以將生物素標(biāo)記的dUTP（BIO-dUTP）標(biāo)記至3’-OH末端，BIO-dUTP結(jié)合在DNA斷點(diǎn)部位，再結(jié)合鏈酶親和素-AP（SABC-AP），BCIP/NBT 予以顯示。凋亡的細(xì) 胞核呈紫藍(lán)色，從而可以在顯微鏡下觀察到著色的凋亡細(xì)胞。
  試劑盒內(nèi)容	1. 標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer)                         5ml 2. 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT,×20)                100μι 3. BIO-dUTP (×20)                                           100μι 4. 封閉液(Blocking Reagent)                            20ml 5. SABC-AP (× 100)                                         100μι 6. Proteinase K (×200)                                     250μι 7.SABC稀釋液                                                   20ml 8.BCIP/NBT顯色劑(×20)                                  1ml 9.陽(yáng)性對(duì)照片                                                     2 張

  
  

  
  

  
  

Instructions

用戶自備試劑

1.         多聚賴氨酸或APES(博士德公司有售)。

2.         0.01M TBS,PH7.5（AR0031博士德公司有售)(配法:1L雙蒸餾水中加入8.5克氯化鈉,1.2克Tris 和0.45—0.5ml純乙酸。)

3.         0.01M TBS,pH9.0--9.5(配法:1L 雙蒸餾水中加入 8.5 克氯化鈉,1.2 克 Tris )。

4.         核固紅—復(fù)染用(博士德公司有售AR0008)。

5.         水溶性封片劑(博士德公司有售AR1018)。

操作步驟

     1.        樣品處理

   (1)      玻片預(yù)先用多聚賴氨酸或APES進(jìn)行處理。

(2)      細(xì)胞涂片和冰凍切片：最重要的是及時(shí)固定。用4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)室溫下固定30—60分鐘。0.01M PBS洗2分鐘×2次。蒸餾水洗滌2分鐘×2次。

(3)      組織：有條件時(shí)應(yīng)及時(shí)固定。常規(guī)4%多聚甲醛/0.01M PBS(PH7.0---7.6)或10%中性緩沖福爾馬林固定4小時(shí)以上，石蠟包埋。切片常規(guī)脫蠟入水（脫蠟務(wù)必干凈）。

2.        標(biāo)本片加0.01M TBS 1:200新鮮稀釋Proteinase K 37℃消化1—15分鐘,0.01M TBS洗2分鐘×3次。(細(xì)胞涂片和冰凍切片一般不消化或消化10—60秒鐘。新鮮石蠟切片消化5-10分鐘。陳舊石蠟切片消化10-15分鐘)。

3.         標(biāo)本片加標(biāo)記緩沖液(Labeling Buffer) 20μl/片,以保持切片濕潤(rùn)。按每張切片取TdT 和BIO-d-UTP各1μl，加入18μl標(biāo)記緩沖液中，混勻。甩去切片上多余液體后加標(biāo)記液，20μl/片。置樣品于濕盒中，37℃標(biāo)記2小時(shí)。

4.        0.01M TBS洗2分鐘×3次。

5.       加封閉液50μl/片，室溫30分鐘，甩掉封閉液，不洗。

6.       用SABC稀釋液1：100稀釋SABC-AP：取 1ml 抗體稀釋液加 SABC-AP 10μl，混勻后 50μl/片加 至切片。37℃反應(yīng) 60 分鐘。0.01M TBS（pH7.5）洗 5 分鐘×4 次。

7.       BCIP/NBT 顯色：BCIP/NBT（×20）按 1：20 的比例用 0.01M TBS (pH9.0-9.5)稀釋，混勻。顯色 液加至標(biāo)本上。避光顯色 20-30 分鐘，若無(wú)背景出現(xiàn)則可繼續(xù)顯色。充分水洗。

8.       必要時(shí)可用核固紅等復(fù)染。水溶性封片劑（博士德有售）封片，也可簡(jiǎn)單地用甘油封片。鏡檢

結(jié)果判定

細(xì)胞核中有紫藍(lán)色顆粒者為陽(yáng)性細(xì)胞，即凋亡的細(xì)胞。

注意事項(xiàng)

1.       試劑盒嚴(yán)格-20℃存放。

2.       初用時(shí)如試管底部無(wú)可見(jiàn)的試劑，在離心機(jī)離心 3 分鐘，使試劑沉至管底。

3.       檢測(cè)過(guò)程中切勿使樣品干涸。

4.       BCIP/NBT 顯色較慢，可適當(dāng)延長(zhǎng)顯色時(shí)間。