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      Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit)是用FITC標(biāo)記的重組人Annexin V來檢測(cè)細(xì)胞凋亡時(shí)出現(xiàn)在細(xì)胞膜表面的磷脂酰絲氨酸的一種細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒?？梢允褂昧魇郊?xì)胞儀、熒光顯微鏡或其它熒光檢測(cè)設(shè)備進(jìn)行檢測(cè)。
      Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報(bào)道可以調(diào)控一些PKC的活性。
      Annexin V選擇性結(jié)合磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷脂酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會(huì)把磷脂酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷脂酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會(huì)促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷脂酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷脂酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。
      用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測(cè)到磷脂酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。
      本試劑盒還提供了碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液，碘化丙啶可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對(duì)于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-FITC可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。
      本試劑盒的流式檢測(cè)效果參考圖1和圖2，熒光顯微鏡檢測(cè)效果參考圖3。

      圖1.細(xì)胞用本試劑盒染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡的效果圖。Jurkat細(xì)胞未經(jīng)處理(A)或用10μM喜樹堿(Camptothecin)作用4小時(shí)(B)后，用本試劑盒染色，然后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞的散射和熒光檢測(cè)。從圖中可以看出，經(jīng)過凋亡誘導(dǎo)劑喜樹堿處理后的細(xì)胞，其Annexin V-FITC染色陽性并且PI染色陰性的細(xì)胞，即凋亡細(xì)胞，明顯增加(B圖的右下象限)，Annexin V-FITC和PI染色雙陽性的細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，也有所增加(B圖的右上象限)。圖中Annexin V-FITC染色陰性PI染色陽性(Annexin V-/PI+)所在象限(A和B圖的左上象限)出現(xiàn)的細(xì)胞點(diǎn)是許可范圍內(nèi)的檢測(cè)誤差。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)可能會(huì)因細(xì)胞類型、細(xì)胞凋亡情況、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。

      圖2.細(xì)胞用本試劑盒染色后流式細(xì)胞儀檢測(cè)效果驗(yàn)證圖。Jurkat細(xì)胞用10μM喜樹堿(Camptothecin)作用4小時(shí)后，未經(jīng)染色(A)、僅用本試劑盒中的PI進(jìn)行染色(B)、僅用本試劑盒中的Annexin V-FITC進(jìn)行染色(C)、用本試劑盒中的Annexin V-FITC和PI進(jìn)行雙染(D)。從圖中可以看出，未經(jīng)染色的是雙陰性細(xì)胞(A)，僅PI染色后出現(xiàn)了預(yù)期的PI染色陽性的細(xì)胞，僅Annexin V-FITC染色出現(xiàn)了預(yù)期的Annexin V-FITC染色陽性的細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙染出現(xiàn)了預(yù)期的僅Annexin V-FITC染色陽性的凋亡細(xì)胞和雙陽性的壞死細(xì)胞。出現(xiàn)的非預(yù)期的細(xì)胞點(diǎn)完全在許可的誤差范圍內(nèi)。實(shí)測(cè)數(shù)據(jù)可能會(huì)因細(xì)胞類型、細(xì)胞凋亡情況、檢測(cè)儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
 

      本試劑盒小包裝C1062S可以檢測(cè)20個(gè)樣品，中包裝C1062M可以檢測(cè)50個(gè)樣品，大包裝C1062L可以檢測(cè)100個(gè)樣品。
包裝清單：

保存條件：
      4℃保存，半年有效。-20℃保存，一年有效。Annexin V-FITC和碘化丙啶染色液需要避光保存。為了長期保存，可以把碘化丙啶染色液適當(dāng)分裝后-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
      盡管經(jīng)測(cè)試Annexin V-FITC反復(fù)凍融5次對(duì)于其檢測(cè)效果無顯著影響，但為取得良好的使用效果，3-6個(gè)月內(nèi)推薦4℃保存，并適當(dāng)注意避免反復(fù)凍融。
      如果有細(xì)菌或真菌污染，會(huì)嚴(yán)重影響檢測(cè)效果。
      染色后宜盡快檢測(cè)，時(shí)間過長可能會(huì)導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
      如果細(xì)胞收集過程中使用了胰酶，需注意設(shè)法去除殘留的胰酶。殘留的胰酶會(huì)消化并降解Annexin V-FITC，導(dǎo)致染色失敗。
      熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進(jìn)行熒光觀察時(shí)，盡量縮短觀察時(shí)間，同時(shí)在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。
      用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC單獨(dú)染色時(shí)出現(xiàn)了過多的PI假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測(cè)，這樣通?？梢杂行p少假陽性的壞死細(xì)胞。
      需自備PBS。
      本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
      為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1. 對(duì)于懸浮細(xì)胞：
a. 在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：PBS重懸不能省略，PBS重懸的過程同時(shí)也起到了洗滌細(xì)胞的作用，可以保證后續(xù)Annexin V-FITC的結(jié)合。
b. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
c. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
d. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
e. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
f. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可立即上機(jī)檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光，流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡的效
果及其驗(yàn)證請(qǐng)參考圖1和圖2。初次進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，建議選擇一組適當(dāng)?shù)募?xì)胞參考圖2設(shè)置未染色、PI單染和Annexin V-FITC單染這3個(gè)對(duì)照。如果用于熒光顯微鏡檢測(cè)，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測(cè)，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測(cè)。用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC單獨(dú)染色時(shí)出現(xiàn)了過多的PI假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測(cè)。
2. 對(duì)于貼壁細(xì)胞的消化后檢測(cè)：
a. 把細(xì)胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，加入適量胰酶細(xì)胞消化液(可含有EDTA)消化細(xì)胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時(shí)，吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。注意：對(duì)于貼壁細(xì)胞，胰酶消化步驟很關(guān)鍵。胰酶消化時(shí)間如果過短，細(xì)胞需要用力吹打才能脫落，容易造成細(xì)胞膜的損傷，從而導(dǎo)致細(xì)胞壞死的假陽性；消化時(shí)間如果過長，同樣易造成細(xì)胞膜損傷而出現(xiàn)細(xì)胞壞死的假陽性，甚至?xí)绊懠?xì)胞膜上磷脂酰絲氨酸與Annexin V-FITC的結(jié)合從而干擾對(duì)于細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。同時(shí)，胰酶細(xì)胞消化液中應(yīng)盡量不含EDTA，因?yàn)镋DTA可能會(huì)影響Annexin V與磷脂酰絲氨酸的結(jié)合。
b. 加入步驟2a中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，把細(xì)胞輕輕吹打下來，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g離心5分鐘，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。注意：加入步驟2a中的細(xì)胞培養(yǎng)液非常重要，一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞，另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可以有效抑制或中和殘留的胰酶。殘留的胰酶會(huì)消化并降解后續(xù)加入的Annexin V-FITC，導(dǎo)致染色失敗。
c. 取5-10萬重懸的細(xì)胞，1000g離心5分鐘，棄上清，加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。
d. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
f. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中?？梢允褂娩X箔進(jìn)行避光。孵育過程中可以重懸細(xì)胞2-3次以改善染色效果。
g. 如果用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)，可立即上機(jī)檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光，流式檢測(cè)的效果及其驗(yàn)
證請(qǐng)參考圖1和圖2。如果用于熒光顯微鏡檢測(cè)，1000g離心5分鐘，收集細(xì)胞，用50-100μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，涂片后，熒光顯微鏡下觀察。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測(cè)，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測(cè)。用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)，如果發(fā)現(xiàn)Annexin V-FITC單獨(dú)染色時(shí)出現(xiàn)了過多的PI假陽性細(xì)胞，并且通過調(diào)整相關(guān)設(shè)置和參數(shù)也無法改善，可以用PBS
將Annexin V-FITC稀釋3-10倍后再進(jìn)行檢測(cè)。
3. 對(duì)于貼壁細(xì)胞的原位熒光檢測(cè)：
注：本方法的優(yōu)點(diǎn)是可以原位觀察細(xì)胞凋亡，缺點(diǎn)是部分凋亡由于不貼壁而檢測(cè)不到。
a. (選做)如果條件許可，把細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板、48孔板或96孔板內(nèi)。在凋亡誘導(dǎo)結(jié)束后，用可以對(duì)多孔板進(jìn)行離心的離心機(jī)1000g離心5分鐘。
b. 吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入PBS洗滌一次。如果條件許可，在吸除PBS前1000g離心5分鐘。
c. 加入195μl Annexin V-FITC結(jié)合液。
d. 加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻。
e. 加入10μl碘化丙啶染色液，輕輕混勻。
f. 室溫(20-25℃)避光孵育10-20分鐘，隨后置于冰浴中。可以使用鋁箔進(jìn)行避光。
g. 隨即在熒光顯微鏡下觀察，Annexin V-FITC為綠色熒光，碘化丙啶(PI)為紅色熒光。注意：細(xì)胞在染色后須盡快完成檢測(cè)，通常宜在1小時(shí)之內(nèi)完成檢測(cè)。

圖3. Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)染色效果圖。圖中綠色熒光為Annexin V-FITC染色陽性細(xì)胞，紅色熒光為碘化丙啶染色陽性細(xì)胞。僅被綠色熒光染色的為凋亡細(xì)胞，被綠色和紅色熒光雙染的是壞死細(xì)胞，未被熒光染色的為正常細(xì)胞。Vehicle組為陰性對(duì)照，Annexin V-FITC染色和碘化丙啶染色都非常弱，L-929細(xì)胞處于正常狀態(tài)；TSZ組為陽性對(duì)照，L-929細(xì)胞用TSZ處理3小時(shí)。TSZ為TNFα、SM-164和Z-VAD-FMK組成的細(xì)胞壞死誘導(dǎo)試劑(C1058)。

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